Aquí ya está sembrado nuestro microorganismo.

De la otra caja Petri sobrante podrás seleccionar las colonias aisladas para realizar tinción de Gram y simple con el fin de evaluar la morfología microscópica de el Rhizobium Etli, así como confirmar si se trata de bacterias Gram negativas.

Esto debido a que las tinciones simples sirven para teñir estructuras fisiológicas de las células, por lo que permite observar la morfología de las bacterias de Rhizobium Etli aisladas: a continuación se muestra una Microfotografía de las bacteria Rhizobium Etli.

Imagen. Microfotografía de Rhizobium Etli con tinción simple de Azul de Metileno. 

(http://www.rhizobium.net/)

Para la tinción :

Previamente se realiza en condiciones estériles el Frotis en seco

Procedimiento de Frotis:

Nota: todo el procedimiento se realiza en condiciones de esterilidad.
1. Se toma un portaobjetos limpio.
2. Se le coloca en el centro una gota de agua destilada.
3. Se toma el asa, se calienta al rojo vivo, se deja enfriar.
4. Se toma con el asa un inoculo de la muestra de Rhizobium y se extiende en círculos sobre la gota en el portaobjetos.
5. Se deja secar y se fija pasándolo 3 veces por el mechero.

Procedimiento para la tinción de Gram:

1. Cubrir el Frotis con dos gotas de Cristal Violeta durante 1 minuto.
2. Lavar cuidadosamente el Frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
3. Sacudir el exceso de agua sin dejar secar, cubrir el Frotis con dos gotas de lugol por 30 segundos.
4. Lavar el Frotis con agua destilada.
5. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante (mezcla alcohol – cetona) dejado que escurra, aproximadamente 10 segundos o hasta que el alcohol se observe transparente.
6. Lavar con agua destilada.
7. Aplicar dos gotas de safranina durante 1 minuto.
8. Lavar nuevamente con agua destilada, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire.
9. Observar al microscopio con seco débil, seco fuerte e inmersión.

Procedimiento para Tinción simple

1. Una vez realizado el Frotis.
2. Cubrir el Frotis con dos cotas de azul de metileno o safranina.
3. Dejar actuar el colorante por 1 minuto
4. Eliminar el exeso de colorante con lavado de agua destilada.
5. Dejar secar al aire.
6. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.




Materiales y reactivos para tinciónes

Tinción de gram:
Portaobjetos
Cristal - Violeta
Lugol - Yodo
Alcohol – Cetona
Safranina
Agua destilada
Asa bacteriológica
Cristalizador
Mechero


Tinción simple:
Azul de metileno
Portaobjetos
Mechero
Aza bacteriana
Cristalizador
Agua destilada

(Flores Gomez, López Jimenez, Luna Fontaine, Moreno Rivera. Manual De Microbiologpia Ambiental. 1ra Ed. Departamento de Biología. Academia de Microbiología. UPIBI - IPN. 2009