GLOSARIO DE TERMINOS

MO= Microorganismo. 

Asada del cultivo= La toma de una muestra, en un medio de cultivo tomada por un asa bacteriológica

Inocular= 1. Introducir una sustancia en un organismo (inocular un veneno), 2. Transmitir por medios artificiales una enfermedad contagiosa.

Cepas= Conjunto de especies bacterianas que comparten, al menos, una característica

Nódulo= Pequeña agrupación de células.

Colonias aisladas= Grupo donde se encuentra un solo tipo de microorganismo que forma una UFC.

UFC= Unidad Formadora de Colonias.

Frotis= Extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos.

Estría simple= Técnica de siembre para aislar un microorganismo dentro de un medio de cultivo.

Amarre de vainas= Conjunto de nódulos adheridos a una raíz.

Parcela= Una superficie de terreno legalmente conformada o dividida.

Macromoléculas= Moléculas que tienen una masa molecular elevada, formadas por un gran número de átomos.

Mesófilo= Organismo cuando tiene una temperatura óptima de crecimiento comprendida entre 20ºC y 45ºC.

Alcalófilo= Organismo que viven en ambientes con pH por encima de 9.

Acidófilo= Organismo, o la estructura del cual, que se desarrolla preferentemente en un medio ácido.

Biofertilizante= Productos que consisten en cepas selectas de microorganismos soportados en material inerte sólido o líquido, para ayudar al crecimiento de un vegetal.

Bacterias Fotosintéticas= Bacterias capaces de producir energía a través de la fotosíntesis.

Heretotrófas= Organismos que son aquellos que deben alimentarse con las sustancias orgánicas sintetizadas por otros organismos.

Microorganismos desnitrificantes= Microorganismo capaces de reducir nitratos hasta Nitrógeno gas. Asimilacion= Proceso mediante el cual una respuesta fenotípica a un factor ambiental es asimilada (a través de la selección natural) por el genotipo de modo que se vuelve independiente del inductor ambiental.

Disimilación= Contraio a la asimilación.

Quimiolitrotrófas= Son aquellos capaces de utilizar compuestos inorgánicos oxidados (CO2) como sustratos para obtener energía y utilizarla en el metabolismo respiratorio.

Rizobacteria= Microorganismos capaces de estimular el crecimiento de una planta, en la zona de la rizosfera.

Rizósfera= Es una parte del suelo inmediata a las raíces donde tiene lugar una interacción dinámica con los microorganismos.

Pesticidas= Sustancias químicas o mezclas de sustancias, destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas.

NOM= Norma Oficial Mexicana.

ELMAC= Agar Manitol extracto de levadura y rojo congo.

mL= Mililitro, unidad para volumen.

g= Gramo, unidad para pesos.

L= Litro, unidad para volumen.

Ton/Ha= Tonelada por Hectarea. M/N= Moneda nacional, peso.

Diagrama representativo de e proceso

Aqui te presentamos un diagrama que resume el trabajo que se requiere para realizar el aislamiento de Rhizobium Etli:

De los tubos inclinados se toma una asada del cultivo y se inoculan por asada en tubos de ensaye con medio Jensen con el objeto de preseleccionar las cepas de Rhizobium Etli por su capacidad de nodular las plantas de frijol.

este medio de cultivo se caracteriza por ser libre de nitrógeno por lo que permite el crecimiento facilitado de el Rhizobium Etli.
Composición del Medio de cultivo Jensen

Reactivos:

· CaHPO4, 1,0 g;
· K2HPO4, 0,2 g;
· MgSO4. 7
· H2O, 0,2 g;
· NaCl, 0,2 g;
· FeCl3, 0,1 g;
· agar, 15,0 g;
· elementos trazas 1 ml
· 1 L de agua destilada.

Materiales:

o Pesa sustancias 1 por cada reactivo.
o Cucharas pala 1 por cada reactivo
o Matraz de Erlenmeyer de 1L
o Tapón de algodón
o Parrilla de calentamiento
o Agitador magnético
o 2 cajas Petri
o 1 tubo de ensaye de 30x200
o Autoclave

Aquí ya está sembrado nuestro microorganismo.

De la otra caja Petri sobrante podrás seleccionar las colonias aisladas para realizar tinción de Gram y simple con el fin de evaluar la morfología microscópica de el Rhizobium Etli, así como confirmar si se trata de bacterias Gram negativas.

Esto debido a que las tinciones simples sirven para teñir estructuras fisiológicas de las células, por lo que permite observar la morfología de las bacterias de Rhizobium Etli aisladas: a continuación se muestra una Microfotografía de las bacteria Rhizobium Etli.

Imagen. Microfotografía de Rhizobium Etli con tinción simple de Azul de Metileno. 

(http://www.rhizobium.net/)

Para la tinción :

Previamente se realiza en condiciones estériles el Frotis en seco

Procedimiento de Frotis:

Nota: todo el procedimiento se realiza en condiciones de esterilidad.
1. Se toma un portaobjetos limpio.
2. Se le coloca en el centro una gota de agua destilada.
3. Se toma el asa, se calienta al rojo vivo, se deja enfriar.
4. Se toma con el asa un inoculo de la muestra de Rhizobium y se extiende en círculos sobre la gota en el portaobjetos.
5. Se deja secar y se fija pasándolo 3 veces por el mechero.

Procedimiento para la tinción de Gram:

1. Cubrir el Frotis con dos gotas de Cristal Violeta durante 1 minuto.
2. Lavar cuidadosamente el Frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
3. Sacudir el exceso de agua sin dejar secar, cubrir el Frotis con dos gotas de lugol por 30 segundos.
4. Lavar el Frotis con agua destilada.
5. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante (mezcla alcohol – cetona) dejado que escurra, aproximadamente 10 segundos o hasta que el alcohol se observe transparente.
6. Lavar con agua destilada.
7. Aplicar dos gotas de safranina durante 1 minuto.
8. Lavar nuevamente con agua destilada, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire.
9. Observar al microscopio con seco débil, seco fuerte e inmersión.

Procedimiento para Tinción simple

1. Una vez realizado el Frotis.
2. Cubrir el Frotis con dos cotas de azul de metileno o safranina.
3. Dejar actuar el colorante por 1 minuto
4. Eliminar el exeso de colorante con lavado de agua destilada.
5. Dejar secar al aire.
6. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.




Materiales y reactivos para tinciónes

Tinción de gram:
Portaobjetos
Cristal - Violeta
Lugol - Yodo
Alcohol – Cetona
Safranina
Agua destilada
Asa bacteriológica
Cristalizador
Mechero


Tinción simple:
Azul de metileno
Portaobjetos
Mechero
Aza bacteriana
Cristalizador
Agua destilada

(Flores Gomez, López Jimenez, Luna Fontaine, Moreno Rivera. Manual De Microbiologpia Ambiental. 1ra Ed. Departamento de Biología. Academia de Microbiología. UPIBI - IPN. 2009

Para la preparación del medio de cultivo:Medio de cultivo “Agar con Manitol, extracto de levadura y rojo congo” (ELMAC)

Después de la incubación una vez obtenido el crecimiento en las placas, de una caja petri deben seleccionarse las colonias aisladas y se siembran en un tubo con agar inclinado por estría simple (Agar con Manitol, extracto de levadura y rojo Congo).

Nota: El medio de cultivo utilizado para la aislamiento de rhizobiumtiene la misma composición que la de sembrado, a excepción del Manitol, el que se reemplazó en un 70% por arabinosa.



Materiales para técnica de estría simple (sembrado)
· Mechero de Fisher.
· Aza bacteriológica.
· Tubos inclinados con medio ELMAR esteriles.
· Inoculo microbiano obtenido de las cajas petri de aislamiento.
· Estufa Incubadora 

Tecnica de estria simple en tubo inclinado:

Comencemos el aislamiento!!!

Para el aislamiento se requiere de medio de cultivo Agar con Manitol, extracto de levadura y Rojo Congo y la composición del medio se indica a continuación:

K2HPO4, 0,5 g
· MgSO4. 7
· H2O, 0,2 g
· NaCl 0.1 g
· extracto de levadura Difco, 1 g
· Manitol, 10 g; Agar 15 g; para 1.000 cc. de agua destilada.

      Según la norma oficial, NOM- 065- SSA1-1993 que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.

      Clasifica al medio de cultivo utilizado para este aislamiento por su aspecto físico como un medio solido que se utiliza para obtener y mantener colonias aisladas de microorganismos.

   

    Así como por su uso  en un medio selectivo por que contener sustancias que impiden el desarrollo de otros microorganismos para permitir el aislamiento de el microorganismo de interés.

Una vez en el laboratorio en condiciones de esterilidad, debe aplanarse el nódulo en 0,5 mL de agua destilada y la suspensión obtenida se sembró con la técnica de estría masiva en 2 cajas Petri con Agar-Manitol-Arabinosa-Rojo Congo previamente preparadas, y se incuban por 24 a 37°C, todo lo anterior con el fin de obtener colonias aisladas de Rhizobium Etli.

Para la preparación del medio:
Reactivos. 

20 g de agar con Manitol - extracto de levadura y rojo congo” (ELMAC) por L de agua destilada

Agar (para medio solido) (20 g)
1L. de agua destilada.


Materiales: 

Pesa sustancias 1 por cada reactivo.
Cucharas pala 1 por cada reactivo
Matraz de Erlenmeyer de 1L
Tapon de algodón
Parrilla de calentamiento
Agitador magnético
2 cajas petri
1 tubo de ensaye de 30x200
Autoclave

Técnica de estría masiva:

Materiales para técnica de estría masiva (aislamiento) :

· Mechero de Fisher

· Asa bacteriológica

· Inoculo microbiano

· Estufa incubadora

Las cajas petri con agar ELMARC con Arabinosa estériles

Antes de aislar: Esterilizar el material!!

Técnica de esterilización para medios de cultivo y material a utilizar

Para cristalería:

El material deberá estar limpio y seco antes de la esterilización.

Tubos de ensaye:

Se tapan con tapón de algodón y se les coloca un gorro de papel Kraft

Se colocan dentro de un bote de lámina con orificios.

Se tapa el bote con papel kraft y se asegura con un a liga

Se coloca cinta indicadora.

Se introduce en la autoclave

Matraz Erlenmeyer:

Se tapan con tapón de algodón y se les coloca un gorro de papel Kraft.

Se coloca cinta indicadora.

Se introduce en la autoclave

Cajas petri

Envolver las cajas en papel kraft en posición invertida.

Se introduce en la autoclave

Imagen 5. Proceso ilustrado de esterilización en autoclave.

Ya tienes el área de estudio???

Una vez elegida la parcela en la que se ha sido aplicado el biofertilizante (Rhizobium Etli), deben identificarse las plantas que contengan el amarre de vainas, que se caracteriza por pequeños nódulos adheridos a las raíces. Para proceder a la extracción (arrancar la planta de raíz).

Luego de la obtención de las raíces noduladas, se deben lavar con agua para remover los restos de suelo y otros contaminantes, los nódulos seleccionados se sumergen en etanol a 95% de 3 a 5 seg. Luego en solución acidificada de Cloruro Mercúrico al 0.1% (0.5 mL de HCl concentrado por cada 100mL de solución). Y finalmente se enjuaga 5 veces con agua destilada.

 (http://www.fao.org/docrep/006/AD315S/AD315S23.htm)

Así todo está listo para ser trasladado.

Es aquí donde termina el trabajo de campo e inicia el trabajo de laboratorio.



Trabajo de campo 

Reactivos

Etanol 95%
Agua destilada
Solución acidificada de Cloruro Mercúrico 0.1%
Agua corriente

Materiales

Tijeras para jardín


2 frascos de vidrio


Guantes para jardín







(Flores Gomez, López Jimenez, Luna Fontaine, Moreno Rivera. Manual De Microbiologpia Ambiental. 1ra Ed. Departamento de Biología. Academia de Microbiología. UPIBI - IPN. 2009)

Trabajo de campo:

Selección del lugar de muestreo:

Para la selección de el lugar de muestreo es necesario conocer si se ha trabajado en tu estado con el microorganismo de tu interés. Que en nuestro caso si se ha trabajado desde algunos años antes, por lo que se sabe que en Zacatecas se ha empleado Rhizobium Etli para optimizar la producción de frijol en ranchos privados de la Localidad  de Miguel Hidalgo, del municipio de  Guadalupe en Zacatecas, y el proyecto se  llevó a cabo con el permiso previo de los productores cooperantes, que por cuestiones de seguridad reservaremos los  nombre de los mismos, que en este caso fueron 3 de el mismo municipio. 

(http://maps.google.com.mx/)

Imagen 4. Ubicación del área seleccionada para el muestreo de Rhizobium Etli, localidad de Miguel Hidalgo del municipio de Guadalupe en Zacatecas.

A continuación se muestran las condiciones de la realización del muestreo agronómico en cada una de las parcelas de los productores cooperantes.

      

Es así como se eligió la parcela del productor número 2 para llevar a cabo el muestreo de este proyecto en nuestro blog.

Imagen 5. parcela elegida a los 75 días de aplicación del biofertilizante.

(http://www.biofabrica.com.mx/site/pdf/biofabrica_Frijol.pdf)

Estas Listo???

A continuación tendrás el paso a paso para el aislamiento de Rhizobium Etli.

jajaj!!!.... bromita, ahora si. 

QUERIDISIMOS LECTORES!!!!!!!!!!

Debido a que nuestro curso esta apunto de terminar y a la urgente necesidad de puntillos extra.

Es necesario que los bañemos con una buena dosis de información con la cual puedan aislar Rhizobium Etli para sus frijolitos de la mañana.

Así que a continuación encontraran los método, materiales, reactivos y demás objetos extraños para aislar nuestro Microorganismos como lo prometimos al inicio.

Importancia Industrial.

El Rhizobium etli, es el huésped de la planta del fríjol, donde experimenta una especie de cambio metabólico: la planta brinda a la bacteria la fuente de carbono que necesita (producto de la fotosíntesis), y ésta le facilita a cambio el nitrógeno asimilable que requiere. Tal asociación permite que leguminosas como el fríjol puedan colonizar suelos pobres en nitrógeno sin necesidad de abusar de los fertilizantes químicos. 

No obstante, a pesar de ser alta la concentración de nitrógeno en la atmósfera, la cantidad que se aprovecha de aquél es mucho menor, pues sólo puede tomarse cuando se encuentra presente en los suelos, formando sales de nitratos y amonio, o incorporado en compuestos orgánicos.

En los cultivos agrícolas, por ejemplo, normalmente se utilizan fertilizantes químicos (nitratos), que si bien nutren a las plantas, también contaminan los mantos friáticos y provocan daños ecológicos al favorecer el crecimiento de bacterias y robar el oxígeno a peces.

Aunque el proceso natural para fijar nitrógeno es sencillo, el oxígeno del ambiente envenena o inactiva las proteínas que participan en él. Ante tal contratiempo, en el curso de su evolución las bacterias desarrollaron diferentes mecanismos para protegerse del oxígeno, creando barreras físicas y produciendo macromoléculas que lo atrapen o reduzcan para generar agua.

Finalmente el beneficio de estudiar como realizan la fijación de nitrógeno los microorganismos, nos ayudará a encontrar medios para reducir o eliminar los fertilizantes nitrogenados, que además causan severos problemas ecológicos.

En este enlace se puede mostrar la paguina de la biofabrica en donde se utilizo por primera vez el Rhizobium etli en la agricultura.

para ver ésta noticia picaleeeee a: noticiaaa!!

Hábitat natural (condiciones)

El Rhizobium etli es una bacteria que para su crecimiento requiere de condiciones no muy estrictas, ya que por su desarrollo en el suelo o tierra para el cultivo principalmente de frijol, la temperatura óptima de crecimiento es entre los 23°C a los 30°C y su tolerancia al pH entra de 5 a 8. Lo cual nos da a saber que se trata de un microorganismo mesófilo y su crecimiento es optimo ya que la mayoria de los ambientes naturales tienen un valor de pH entre 5 y 9 lo que hace que este microorganismo cresca sin necesidad de ser alcalófilo o acidófilo.

Frijolitos bayos !!!!!

Se preguntaran: ¿que tiene que ver un frijol con nuestro Microorganismo?

Imagen 2. Muestra de el tipo de semillas genrminantes en las que puede estudiarse Rhizobium Etli.

Pues en realidad en nuestro país es uno de los productos agrícolas que se ven más beneficiados por las bondades de el Rhizobium, Etli. Ya que se utiliza como biofertilizante para legumbres.

¿QUÉ TIPO DE NUTRICIÓN TIENE LA RHIZOBIUM ETLI?

La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterotrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada:

Como NO3, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitrito-reductasas asimilatorias.

Muchas bacterias heterotrofas pueden usar alguna forma reducida.

N inorgánico: amonio (NH4+)

La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N₂), que procede de microorganismos desnitrificantes.

La nitrificación es un proceso de asimilación, mientras que la desnitrificación seconsidera un proceso de disimilación.

"Las bacterias nitrificantes son quimiolitrotrofas".

ACERCA DE NUESTRO MICROORGANISMO

Nombre y Tipo de Microorganismo

Rhizobium etli es una rizobacteria benéfica del fríjol porque fija N2 en los nódulos de sus raíces, cuando estas plantas se siembran en el suelo sin suficiente nitrógeno inorgánico combinado, que supla la demanda nutricional del fríjol. Mientras que para evitar que insectos-plaga anulen este efecto positivo de R. etli en la leguminosa. En la agricultura convencional es necesario aplicar pesticidas para protección de los cultivos vegetales.

Los resultados de este trabajo indican la factibilidad de seleccionar R. etli que conserve su capacidad de nodular y fijar N2, al mismo tiempo que sea tolerante a pesticidas, lo que asegure su efecto positivo en la producción sostenible de frijol.

Imagen 1. Raíz de frijol nodulada por Rhizobium etli.

BIEEEEEENVENIDOS A NUESTRO BLOG!

Debido a que el mundo de la Microbiología es un tanto inaccesible para la gente normal. Nosotros, bondadosos y apiadados alumnos de la Unidad de Aprendizaje de Microbiología Ambiental, creamos un espacio en el cual se describan los procesos de "Aislamiento e Identificación de un Microorganismo de Importancia Ambiental" en este caso dirigido al grandioso, fantástico y descomunal: RHIZOBIUM ETLI.