GLOSARIO DE TERMINOS

MO= Microorganismo. 

Asada del cultivo= La toma de una muestra, en un medio de cultivo tomada por un asa bacteriológica

Inocular= 1. Introducir una sustancia en un organismo (inocular un veneno), 2. Transmitir por medios artificiales una enfermedad contagiosa.

Cepas= Conjunto de especies bacterianas que comparten, al menos, una característica

Nódulo= Pequeña agrupación de células.

Colonias aisladas= Grupo donde se encuentra un solo tipo de microorganismo que forma una UFC.

UFC= Unidad Formadora de Colonias.

Frotis= Extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos.

Estría simple= Técnica de siembre para aislar un microorganismo dentro de un medio de cultivo.

Amarre de vainas= Conjunto de nódulos adheridos a una raíz.

Parcela= Una superficie de terreno legalmente conformada o dividida.

Macromoléculas= Moléculas que tienen una masa molecular elevada, formadas por un gran número de átomos.

Mesófilo= Organismo cuando tiene una temperatura óptima de crecimiento comprendida entre 20ºC y 45ºC.

Alcalófilo= Organismo que viven en ambientes con pH por encima de 9.

Acidófilo= Organismo, o la estructura del cual, que se desarrolla preferentemente en un medio ácido.

Biofertilizante= Productos que consisten en cepas selectas de microorganismos soportados en material inerte sólido o líquido, para ayudar al crecimiento de un vegetal.

Bacterias Fotosintéticas= Bacterias capaces de producir energía a través de la fotosíntesis.

Heretotrófas= Organismos que son aquellos que deben alimentarse con las sustancias orgánicas sintetizadas por otros organismos.

Microorganismos desnitrificantes= Microorganismo capaces de reducir nitratos hasta Nitrógeno gas. Asimilacion= Proceso mediante el cual una respuesta fenotípica a un factor ambiental es asimilada (a través de la selección natural) por el genotipo de modo que se vuelve independiente del inductor ambiental.

Disimilación= Contraio a la asimilación.

Quimiolitrotrófas= Son aquellos capaces de utilizar compuestos inorgánicos oxidados (CO2) como sustratos para obtener energía y utilizarla en el metabolismo respiratorio.

Rizobacteria= Microorganismos capaces de estimular el crecimiento de una planta, en la zona de la rizosfera.

Rizósfera= Es una parte del suelo inmediata a las raíces donde tiene lugar una interacción dinámica con los microorganismos.

Pesticidas= Sustancias químicas o mezclas de sustancias, destinadas a matar, repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas.

NOM= Norma Oficial Mexicana.

ELMAC= Agar Manitol extracto de levadura y rojo congo.

mL= Mililitro, unidad para volumen.

g= Gramo, unidad para pesos.

L= Litro, unidad para volumen.

Ton/Ha= Tonelada por Hectarea. M/N= Moneda nacional, peso.

Diagrama representativo de e proceso

Aqui te presentamos un diagrama que resume el trabajo que se requiere para realizar el aislamiento de Rhizobium Etli:

De los tubos inclinados se toma una asada del cultivo y se inoculan por asada en tubos de ensaye con medio Jensen con el objeto de preseleccionar las cepas de Rhizobium Etli por su capacidad de nodular las plantas de frijol.

este medio de cultivo se caracteriza por ser libre de nitrógeno por lo que permite el crecimiento facilitado de el Rhizobium Etli.
Composición del Medio de cultivo Jensen

Reactivos:

· CaHPO4, 1,0 g;
· K2HPO4, 0,2 g;
· MgSO4. 7
· H2O, 0,2 g;
· NaCl, 0,2 g;
· FeCl3, 0,1 g;
· agar, 15,0 g;
· elementos trazas 1 ml
· 1 L de agua destilada.

Materiales:

o Pesa sustancias 1 por cada reactivo.
o Cucharas pala 1 por cada reactivo
o Matraz de Erlenmeyer de 1L
o Tapón de algodón
o Parrilla de calentamiento
o Agitador magnético
o 2 cajas Petri
o 1 tubo de ensaye de 30x200
o Autoclave

Aquí ya está sembrado nuestro microorganismo.

De la otra caja Petri sobrante podrás seleccionar las colonias aisladas para realizar tinción de Gram y simple con el fin de evaluar la morfología microscópica de el Rhizobium Etli, así como confirmar si se trata de bacterias Gram negativas.

Esto debido a que las tinciones simples sirven para teñir estructuras fisiológicas de las células, por lo que permite observar la morfología de las bacterias de Rhizobium Etli aisladas: a continuación se muestra una Microfotografía de las bacteria Rhizobium Etli.

Imagen. Microfotografía de Rhizobium Etli con tinción simple de Azul de Metileno. 

(http://www.rhizobium.net/)

Para la tinción :

Previamente se realiza en condiciones estériles el Frotis en seco

Procedimiento de Frotis:

Nota: todo el procedimiento se realiza en condiciones de esterilidad.
1. Se toma un portaobjetos limpio.
2. Se le coloca en el centro una gota de agua destilada.
3. Se toma el asa, se calienta al rojo vivo, se deja enfriar.
4. Se toma con el asa un inoculo de la muestra de Rhizobium y se extiende en círculos sobre la gota en el portaobjetos.
5. Se deja secar y se fija pasándolo 3 veces por el mechero.

Procedimiento para la tinción de Gram:

1. Cubrir el Frotis con dos gotas de Cristal Violeta durante 1 minuto.
2. Lavar cuidadosamente el Frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
3. Sacudir el exceso de agua sin dejar secar, cubrir el Frotis con dos gotas de lugol por 30 segundos.
4. Lavar el Frotis con agua destilada.
5. Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante (mezcla alcohol – cetona) dejado que escurra, aproximadamente 10 segundos o hasta que el alcohol se observe transparente.
6. Lavar con agua destilada.
7. Aplicar dos gotas de safranina durante 1 minuto.
8. Lavar nuevamente con agua destilada, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire.
9. Observar al microscopio con seco débil, seco fuerte e inmersión.

Procedimiento para Tinción simple

1. Una vez realizado el Frotis.
2. Cubrir el Frotis con dos cotas de azul de metileno o safranina.
3. Dejar actuar el colorante por 1 minuto
4. Eliminar el exeso de colorante con lavado de agua destilada.
5. Dejar secar al aire.
6. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.




Materiales y reactivos para tinciónes

Tinción de gram:
Portaobjetos
Cristal - Violeta
Lugol - Yodo
Alcohol – Cetona
Safranina
Agua destilada
Asa bacteriológica
Cristalizador
Mechero


Tinción simple:
Azul de metileno
Portaobjetos
Mechero
Aza bacteriana
Cristalizador
Agua destilada

(Flores Gomez, López Jimenez, Luna Fontaine, Moreno Rivera. Manual De Microbiologpia Ambiental. 1ra Ed. Departamento de Biología. Academia de Microbiología. UPIBI - IPN. 2009

Para la preparación del medio de cultivo:Medio de cultivo “Agar con Manitol, extracto de levadura y rojo congo” (ELMAC)

Después de la incubación una vez obtenido el crecimiento en las placas, de una caja petri deben seleccionarse las colonias aisladas y se siembran en un tubo con agar inclinado por estría simple (Agar con Manitol, extracto de levadura y rojo Congo).

Nota: El medio de cultivo utilizado para la aislamiento de rhizobiumtiene la misma composición que la de sembrado, a excepción del Manitol, el que se reemplazó en un 70% por arabinosa.



Materiales para técnica de estría simple (sembrado)
· Mechero de Fisher.
· Aza bacteriológica.
· Tubos inclinados con medio ELMAR esteriles.
· Inoculo microbiano obtenido de las cajas petri de aislamiento.
· Estufa Incubadora 

Tecnica de estria simple en tubo inclinado:

Comencemos el aislamiento!!!

Para el aislamiento se requiere de medio de cultivo Agar con Manitol, extracto de levadura y Rojo Congo y la composición del medio se indica a continuación:

K2HPO4, 0,5 g
· MgSO4. 7
· H2O, 0,2 g
· NaCl 0.1 g
· extracto de levadura Difco, 1 g
· Manitol, 10 g; Agar 15 g; para 1.000 cc. de agua destilada.

      Según la norma oficial, NOM- 065- SSA1-1993 que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.

      Clasifica al medio de cultivo utilizado para este aislamiento por su aspecto físico como un medio solido que se utiliza para obtener y mantener colonias aisladas de microorganismos.

   

    Así como por su uso  en un medio selectivo por que contener sustancias que impiden el desarrollo de otros microorganismos para permitir el aislamiento de el microorganismo de interés.

Una vez en el laboratorio en condiciones de esterilidad, debe aplanarse el nódulo en 0,5 mL de agua destilada y la suspensión obtenida se sembró con la técnica de estría masiva en 2 cajas Petri con Agar-Manitol-Arabinosa-Rojo Congo previamente preparadas, y se incuban por 24 a 37°C, todo lo anterior con el fin de obtener colonias aisladas de Rhizobium Etli.

Para la preparación del medio:
Reactivos. 

20 g de agar con Manitol - extracto de levadura y rojo congo” (ELMAC) por L de agua destilada

Agar (para medio solido) (20 g)
1L. de agua destilada.


Materiales: 

Pesa sustancias 1 por cada reactivo.
Cucharas pala 1 por cada reactivo
Matraz de Erlenmeyer de 1L
Tapon de algodón
Parrilla de calentamiento
Agitador magnético
2 cajas petri
1 tubo de ensaye de 30x200
Autoclave

Técnica de estría masiva:

Materiales para técnica de estría masiva (aislamiento) :

· Mechero de Fisher

· Asa bacteriológica

· Inoculo microbiano

· Estufa incubadora

Las cajas petri con agar ELMARC con Arabinosa estériles

Antes de aislar: Esterilizar el material!!

Técnica de esterilización para medios de cultivo y material a utilizar

Para cristalería:

El material deberá estar limpio y seco antes de la esterilización.

Tubos de ensaye:

Se tapan con tapón de algodón y se les coloca un gorro de papel Kraft

Se colocan dentro de un bote de lámina con orificios.

Se tapa el bote con papel kraft y se asegura con un a liga

Se coloca cinta indicadora.

Se introduce en la autoclave

Matraz Erlenmeyer:

Se tapan con tapón de algodón y se les coloca un gorro de papel Kraft.

Se coloca cinta indicadora.

Se introduce en la autoclave

Cajas petri

Envolver las cajas en papel kraft en posición invertida.

Se introduce en la autoclave

Imagen 5. Proceso ilustrado de esterilización en autoclave.